Differential expression of NEDD8 in different pathological types of chronic rhinosinusitis with nasal polyps
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摘要: 目的 分析不同病理类型的慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)患者的鼻息肉组织中神经前体细胞表达发育下调蛋白8(Neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8，NEDD8)表达水平差异。方法 使用在北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科因慢性鼻窦炎行鼻内镜手术的患者标本。利用苏木精-伊红染色检测鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞数量，并根据鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞的数量对CRSwNP患者进行分组，采用免疫组织化学法检测分析鼻息肉组织中的NEDD8蛋白表达水平。结果 嗜酸性粒细胞型慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻息肉中NEDD8蛋白表达水平显著高于非嗜酸性粒细胞型慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者(P<0.05)。NEDD8蛋白表达水平和鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞数量呈显著正相关(r=0.79，P=0.02)。结论 不同病理类型的CRSwNP患者NEDD8蛋白表达存在差异。
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关键词:
- 神经前体细胞表达发育下调蛋白8 /
- 鼻窦炎 /
- 鼻息肉 /
- 嗜酸性粒细胞
Abstract: Objective To analyze the differential expression of neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8(NEDD8) protein in nasal polyp tissues of patients with different pathological types of chronic rhinorhinosinusitis with nasal polyps(CRSwNP).Methods All specimens were obtained from the specimen library of Beijing Tongren Hospital, and were all patients who underwent nasal endoscopic surgery for chronic rhinosinusitis in Beijing Tongren Hospital. Hematoxylin-eosin staining(HE) was used to detect the number of eosinophils in nasal polyps, and CRSwNP patients were grouped according to the number of eosinophils in nasal polyps, immunohistochemistry was used to detect and analyze the expression level of NEDD8 protein in nasal polyps.Results The expression level of NEDD8 protein in nasal polyps of patients with eosinophilic chronic rhinorhinosinusitis with nasal polyps was significantly higher than that of patients with non-eosinophilic chronic rhinosinusitis and nasal polyps(P<0.05). In addition, there was a significant positive correlation between the expression level of NEDD8 protein and the number of eosinophils in nasal polyp tissue(r=0.79, P=0.02).Conclusion There are differences in the expression of NEDD8 protein in patients with chronic rhinosinusitis and nasal polyps of different pathological types. -
慢性鼻窦炎伴鼻息肉(chronic rhinorhinosinusitis with nasal polyps，CRSwNP)是一种以炎性细胞浸润和组织水肿为主要症状的慢性异质性疾病，鼻堵、嗅觉减退及头痛是其常见临床症状且症状持续12周以上，也是颅内并发症、精神疾病等疾病的诱因之一，严重影响了患者的生活质量甚至生命安全[1-3]。根据鼻息肉组织中炎性细胞浸润水平差异，CRSwNP被划分为嗜酸性粒细胞型(eosinophilic chronic rhinorhinosinusitis with nasal polyps，ECRSwNP)和非嗜酸性粒细胞型(non-eosinophilic chronic rhinorhinosinusitis with nasal polyps，nonECRSwNP)，其中组织嗜酸性粒细胞百分比超过54.5%时ECRSwNP复发率高达99.0%[1, 4-5]，提示ECRSwNP和nonECRSwNP可能在疾病的发生、发展机制上有差异。
神经前体细胞表达发育下调蛋白8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8，NEDD8)是一种泛素样蛋白，可激活E3连接酶家族，即cullin-RING连接酶，在成人组织中广泛表达[6]。NEDD8特异性共价连接到底物蛋白上的过程称为Neddylation修饰，是一种新型的蛋白质翻译后修饰，广泛参与先天免疫和适应性免疫，在多种炎症性疾病中至关重要[6-8]。已有研究显示，NEDD8过表达以及随后的Neddylation修饰可驱动多种炎症、自身免疫性疾病及癌症的发展。例如NEDD8在鼻咽癌组织中的表达升高与鼻咽癌患者的预后较差有关，敲低NEDD8表达能够抑制耐药性[9]。Neddylation修饰通路在炎症反应期间调节T细胞、B细胞、巨噬细胞和内皮细胞的功能中起着关键作用，Neddylation化抑制剂可用作潜在的抗炎剂[10-13]。但是，目前NEDD8蛋白在CRSwNP中的作用尚不清楚，NEDD8蛋白在CRSwNP中的表达有待研究。本研究旨在探究NEDD8蛋白在不同病理类型慢性鼻窦炎伴鼻息肉患者鼻息肉组织中的表达与差异。
1. 材料与方法
1.1 标本收集
本研究所使用的CRSwNP患者标本，来自我院标本库，均为因CRSwNP就诊于我院行鼻内镜手术治疗的患者，鼻息肉的诊断标准依据欧洲慢性鼻窦炎及鼻息肉共识(European Position Paper on Rhinorhinosinusitis and Nasal Polyps 2020，EPOS2020)[1]。纳入标准：18~70岁患者；双侧鼻息肉，息肉Davos总评分>4；入组前未使用皮质醇激素或抗生素治疗。排除标准：单侧病变；真菌性鼻窦炎；患免疫系统疾病等。本研究中用于免疫组织化学染色的标本为8例未经激素等药物治疗的CRSwNP患者鼻息肉石蜡组织，年龄46~57岁，平均(51.5 ±3.0)岁。所有受试者均签署知情同意书，获知其组织将被保存并用于科学研究。
1.2 免疫组织化学检测鼻息肉组织NEDD8蛋白表达
免疫组织化学方法按照以前研究报道的方法进行[14]：将术后获得的鼻息肉组织使用生理盐水迅速冲洗后立即置于10%甲醛溶液固定24 h，然后进行石蜡包埋。将石蜡包埋后的组织进行连续切片，厚度5 μm，再经过脱蜡至水、抗原修复(高压热修复)、3% H2O2阻断内源性过氧化物酶活性、3%山羊血清阻断非特异性结合、一抗孵育(NEDD8抗体，稀释浓度1︰75)、二抗孵育、DAB显色、苏木素复染、脱水、封片，完成鼻息肉组织中NEDD8蛋白表达水平的免疫组织化学检测。
1.3 鼻息肉组织病理分型
鼻息肉组织经固定、脱水、透明、石蜡包埋后进行常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色封片过程，使用Olympus BX51显微镜观察成像。高倍(×400)显微镜下(High power field，HPF)随机选取5个不连续视野对鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞个数进行计数，取5个视野平均值作为该样本的嗜酸性粒细胞个数。CRSwNP鼻息肉组织分型标准参照Lou等[15]基于临床结果得到的分界标准，即当鼻息肉组织中5个高倍视野的平均嗜酸性粒细胞个数>55或占比>27%时，纳入ECRSwNP组；当鼻息肉组织中5个高倍视野平均嗜酸性粒细胞个数≤55或占比≤27%时，则纳入nonECRSwNP组。
1.4 统计学处理
使用Image Pro Plus 6.0软件评估NEDD8蛋白阳性染色的积分光密度(integrated optical densities，IOD)值[16-17]，每个组织取5个不连续视野进行IOD值评估并取平均值，IOD值越大代表目的蛋白NEDD8表达水平越高。进行差异分析时，正态分布数据使用不成对的双尾Student t检验，非正态数据使用Mann-Whitney检验，P<0.05为差异有统计学意义。平均嗜酸性粒细胞个数(EOS number)和平均NEDD8 IOD经log10处理后使用Spearman秩相关系数分析研究变量之间的相关性。
2. 结果
2.1 CRSwNP患者病理分型
本研究根据HE组织病理学检查结果，将CRSwNP患者分为ECRSwNP组(4例)和nonECRSwNP组(4例)。ECRSwNP组每例患者的息肉组织中平均嗜酸性粒细胞个数分别为233.6、87.8、140.2、87.2，ECRSwNP组鼻息肉组织嗜酸性粒细胞计数为(137.2±59.7)，大于55个/HPF。nonECRSwNP组每例患者的息肉组织中平均嗜酸性粒细胞个数分别为3.8、8.8、3.8、6.4，nonECRSwNP组鼻息肉组织嗜酸性粒细胞计数为(5.7±2.1)，少于55个/HPF，见图 1。2组比较，嗜酸性粒细胞计数差异有统计学意义(P<0.05)，见图 2。
图 1 CRSwNP患者的鼻息肉组织病理检测(苏木精-伊红染色×400)a：大量嗜酸性粒细胞浸润的ECRSwNP患者鼻息肉组织；b：少见嗜酸性粒细胞浸润的nonECRSwNP患者鼻息肉组织。 2.2 不同病理类型CRSwNP患者鼻息肉组织NEDD8蛋白表达差异
对免疫组织化学染色结果进行半定量分析，比较2组间NEDD8蛋白表达水平差异，NEDD8蛋白阳性染色的IOD值越大代表组织中NEDD8蛋白表达水平越高，结果显示ECRSwNP组NEDD8蛋白表达水平显著高于nonECRSwNP组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图 3。
2.3 CRSwNP患者NEDD8蛋白表达水平与嗜酸性粒细胞计数的相关性
为了解鼻息肉组织中NEDD8蛋白表达水平(IOD value of NEDD8)和嗜酸性粒细胞个数(Eos number)之间的关系，本研究对鼻息肉组织中NEDD8蛋白表达水平和嗜酸性粒细胞个数进行了Spearman相关性分析，结果显示NEDD8蛋白表达水平和鼻息肉组织中嗜酸性粒细胞数量呈显著正相关(r=0.79，P=0.02)，见图 4。
3. 讨论
作为一种常见的慢性异质性疾病，慢性鼻窦炎典型的生理特征是持续的炎症反应和异常的组织重塑[18-19]。重塑是组织损伤后修复重建的关键过程，而异常重塑过程就会导致病理性组织状态[19]。CRSwNP患者的鼻黏膜由于受到外环境持续的环境刺激与内环境持续炎症浸润而受损，局部组织进行修复时发生了异常重塑过程，最终造成了病理性组织状态，例如黏液纤毛系统受损、上皮屏障完整性和通透性破坏、黏膜下纤维蛋白沉积及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)异常降解等[20]。ECM蛋白在基质-金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)的作用下会发生降解，所以MMP的异常表达会使ECM中的蛋白异常降解，造成间质组织疏松及组织水肿等[21-22]。另外，MMPs还可以通过调节细胞因子和趋化因子的活性参与免疫细胞的募集和激活，这些免疫细胞会进一步释放MMPs和炎症细胞因子，造成炎症和组织损伤的循环[23]。研究显示MMPs在CRS中的表达水平普遍上调，但是调控MMP表达的上游机制尚不清楚。
Th2型炎症主导的鼻息肉具有特殊的重塑特征和临床难治的特点。既有研究显示，Th2型细胞因子参与了部分MMP的表达调控。例如，Th2型细胞因子IL-13能够促进IL-19的产生，而IL-19通过ERK(extracellular regulated protein kinases)和NF-κB(Nuclear factor kappa-B)信号通路可以上调MMP-9的表达[24]。Th2细胞因子IL-4、IL-13可以通过ERK和STAT6(signal transducer and activator of transcription 6)信号通路促进上皮细胞的骨膜蛋白表达，进而诱导成纤维细胞和上皮细胞的MMPs表达[25]。同时，骨膜蛋白还可以通过整合素结合激活上皮细胞胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)分泌，上皮来源的TSLP再激活肥大细胞产生IL-5，并通过树突状细胞诱导Th2炎症，形成正反馈的炎症网络[26]。
NEDD8作为泛素样蛋白，在体内广泛参与蛋白降解或蛋白生物活性调控过程，越来越多的研究显示其在调节炎症性疾病中发挥关键作用。例如，NEDD8在类风湿性关节炎患者的滑膜中显著上调[27]，敲低NEDD8可以大大减少呼吸道合胞病毒感染细胞的IL-1β表达水平，沉默巨噬细胞和上皮细胞中的NEDD8可减少IL-1β分泌等[28]。NF-κB家族包括主要负责炎症反应和细胞存活的异二聚体转录因子，在没有胞外信号传导的情况下，NF-κB位于细胞质中并被IκB家族成员抑制。既往研究发现，NEDD8蛋白可以通过降解NF-κB等通路中炎症因子介导的磷酸化IκB激酶等，进而激活炎症相关信号通路[29-30]，上调TNF-α、IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-13等表达水平[31-34]，从而参与ECM异常降解与组织重塑[21]。
MMP是一组锌依赖性酶，在ECM重塑和降解其成分中发挥关键作用，从而诱发持续性组织创伤和异常重塑[35-36]。CRSwNP的特征是鼻窦黏膜明显水肿，伴有炎症募集和局部组织降解[1]。既往研究发现，在ECRSwNP中有较高水平的MMP-1表达，而且MMP-1 mRNA表达水平只在ECRSwNP中上调[37]，说明NEDD8可能在MMP-1分泌增加中发挥作用，尤其是在ECRSwNP中，提示NEDD8蛋白可能在ECRSwNP的组织降解和重塑中发挥重要作用。本研究免疫组织化学结果显示，NEDD8蛋白在ECRSwNP组中的表达水平显著高于nonECRSwNP组。相关性分析结果显示，鼻息肉组织中NEDD8蛋白表达水平与嗜酸性粒细胞数量呈显著正相关，提示NEDD8可能与嗜酸性粒细胞的招募有关。ECRSwNP以Th2型炎症为主，nonECRSwNP以非Th2型炎症为主，另外ECRSwNP患者鼻息肉组织中的嗜酸性粒细胞数量显著高于nonECRSwNP，嗜酸性粒细胞会促进Th2细胞的募集和功能，提示Th2细胞因子可能介导了NEDD8招募嗜酸性粒细胞的过程，也提示NEDD8有作为CRSwNP预后生物标志物的潜力。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
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